細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)概述

無菌操作基本技術(shù)
1. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺(tái)(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 %
ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。每
次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間
污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間
隔應(yīng)讓無菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。
2. 無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可
以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70 % ethanol 擦
拭后才帶入無菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操
作。
3. 小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打
開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，
盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來自人類或是病毒
感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)之無菌操作臺(tái)(至少Class II)。操作過程
中，應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心****，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳
針頭之傷害等。
5. 定期檢測下列項(xiàng)目：
5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力
5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。
5.3. 無菌操作臺(tái)內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300
小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。
一、技術(shù)信息：細(xì)胞和培養(yǎng)液
貯存要求：
細(xì)胞：
貨一到，即刻做好培養(yǎng)前準(zhǔn)備，如開好水浴，保持37℃，再從干冰中取出細(xì)胞株，放入水浴中，不停的搖動(dòng)直到細(xì)胞株*解凍。在無菌的工作臺(tái)里，把解凍好的細(xì)胞株用灑精棉球擦凍存管的外殼，預(yù)防操作污染。然后把細(xì)胞株和自帶液體，平均移到兩瓶裝有15ml—20ml的培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶里面（不需要做細(xì)胞株離心，這種損害遠(yuǎn)比二甲基亞砜更大）。
注意：整個(gè)操作流程均遵守?zé)o菌操作。
培養(yǎng)液：
把Clonetics細(xì)胞培養(yǎng)液貯藏在4℃的冰箱中。使用培養(yǎng)液時(shí)，需在無菌的條件下，取出您需要的量，然后把瓶子放回冰箱中。在使用前，務(wù)必使培養(yǎng)液恢復(fù)室溫。
補(bǔ)充物和試劑
如果您計(jì)劃在三天內(nèi)次培養(yǎng)，貯存所有的生長補(bǔ)充物——HEPES緩沖鹽溶液和4℃下的*中性溶液。Trypsin/EDTA溶液在4℃下貯藏壽命有限。貨一到，如果Trypsin/EDTA溶液解凍，立刻分成部分并再次使之冷凍到-20℃；如果Trypsin/EDTA溶液凍結(jié)，貯藏在-20℃條件下。如果您不打算在三天內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，把所有的生長補(bǔ)充物和次培養(yǎng)試劑貯藏在-20℃的冰柜中。
Clonetics細(xì)胞的安全預(yù)防
•為預(yù)防污染，在處理來自人體的細(xì)胞產(chǎn)品時(shí)請(qǐng)遵照來自J.的組織培養(yǎng)方法——“Guidelines to Avoid Personnel Contamination By Infective Agents in Research Laboratories That Use Human Tissues”——概括的所有程序。
•用這些材料時(shí)，務(wù)必戴上手套和安全鏡。用冷凍細(xì)胞時(shí)，要小心操作；快速的溫度變化可能會(huì)導(dǎo)致液氮的飛濺。
•在進(jìn)行操作以前，要對(duì)手進(jìn)行*地清洗。
•在細(xì)胞或試劑操作的區(qū)域，不要吸煙，吃飯，喝酒。
•決不能用嘴吹移液管。
•來自人體和動(dòng)物的產(chǎn)品都有潛在的生物危險(xiǎn)性。盡管人體細(xì)胞系在PCR檢測中對(duì)HIV-1、乙肝和丙肝為陰性，還是有必要采取適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施以避免疏忽的暴露。
準(zhǔn)備培養(yǎng)液
在無菌條件下按以下步驟操作
對(duì)一瓶*是補(bǔ)充液的培養(yǎng)液，操作如下：
1． 如需要，加BBE或BPE于500ml的基本培養(yǎng)液中。
a. 把BBE或BPE補(bǔ)充物從培養(yǎng)瓶中分離
b. 用乙醇或異丙醇清洗小瓶和培養(yǎng)瓶
c. 用移液管把瓶中所有的內(nèi)容物（大約2ml）放入培養(yǎng)基中。用培養(yǎng)基沖洗裝BBE的小瓶并用移液管把培養(yǎng)基移回到500ml的瓶中。
d. 蓋上蓋子，輕輕地旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)液幾次使之混合。
e. 記上BBE或BPE加入到培養(yǎng)液時(shí)的日期。
對(duì)BulletKits®，遵循以下步驟：
1. 用乙醇或異丙醇清洗SingleQuots®冷凍管外表面和基本培養(yǎng)瓶。
2. 無菌條件下打開冷凍管，用移液管把冷凍管中所有的液體移入到基本培養(yǎng)液中。
3. 用培養(yǎng)液清洗冷凍管。冷凍管中的液體不可能*移入到培養(yǎng)液中。小的損失，即使達(dá)到10%不會(huì)影響補(bǔ)充培養(yǎng)液的細(xì)胞生長特性。
4. 把試劑盒提供的標(biāo)簽轉(zhuǎn)移到裝有補(bǔ)充液的基本培養(yǎng)瓶上。用它記錄日期和每次加入的補(bǔ)充物的量。我們建議您把*標(biāo)簽貼在基本培養(yǎng)液標(biāo)簽上，這樣可避免雙倍的添加和混淆。
5. 根據(jù)貯藏壽命在標(biāo)簽上寫上有效期。*重新組裝的BulletKits有效期30天。這種補(bǔ)充培養(yǎng)液現(xiàn)在被用作生長培養(yǎng)液。
開始之前
在你準(zhǔn)備培養(yǎng)液和細(xì)胞以前，請(qǐng)遵循以下步驟：
1． 預(yù)備一個(gè)無菌的環(huán)境
無菌的環(huán)境包括*，前面有個(gè)敞開的入口和透過性流線式通口或一個(gè)等同的裝置。
2． 決定所需培養(yǎng)液的量
參看一般塑料器皿的生長面積表以此來決定要用的培養(yǎng)液的量。
3.需用的無菌儀器和試管
•無菌可隨意使用的血清學(xué)上使用的移液管
•微型移液管和無菌移液尖
•可調(diào)節(jié)的多孔道的移液管和可重復(fù)使用的移液管
•盛裝多孔道移液管的無菌貯藏盒
•15ml無菌離心管
•細(xì)胞培養(yǎng)瓶
•多孔平底的組織培養(yǎng)板
•血球計(jì)或細(xì)胞計(jì)數(shù)器
4.其他需求的試劑：
•70%酒精（乙醇或異丙醇）
•生長培養(yǎng)液（特定細(xì)胞株）
•保護(hù)性手套和外罩
•臺(tái)盼藍(lán)
5． 為zui初的實(shí)驗(yàn)草案計(jì)劃和準(zhǔn)備
要依據(jù)伴隨有產(chǎn)品的分析證書上標(biāo)明的細(xì)胞數(shù)。
6． 要核對(duì)培養(yǎng)箱中的濕度刻度。培養(yǎng)箱應(yīng)保持潮濕和37℃，裝有5%CO2和95%空氣。
培養(yǎng)已定的貼壁細(xì)胞株
這些說明不適用于RHNP,hNHEPS®,rtNHEPS,smNHEPSTM,NHDC,HPBMC和生血的干細(xì)胞。
1．計(jì)算要用的器皿的個(gè)數(shù)。參看分析證書，決定你試管中需要的確切的細(xì)胞數(shù)。參看6.3頁的“普通塑料器皿的生長面積”表有助于調(diào)節(jié)這種計(jì)數(shù)。
如果種植密度為2500細(xì)胞/cm2、3500細(xì)胞/cm2或5000細(xì)胞/cm2
請(qǐng)遵循以下計(jì)數(shù)法來算出所需器皿的個(gè)數(shù)。
(可裝的細(xì)胞數(shù)х百分存活率)/建議的細(xì)胞密度=能種植的zui多細(xì)胞數(shù)/cm2
能種植的zui多細(xì)胞數(shù)/平方厘米/試管有效生長面積=需準(zhǔn)備的zui多試管數(shù)
用多個(gè)T-25試管而不用一個(gè)等量的相對(duì)大的試管的優(yōu)點(diǎn)，就是減少了一下子失去大量細(xì)胞的冒險(xiǎn)性。也就是說，如果一個(gè)T-25試管*化有問題，還有其他的T-25試管可用。
2． 試劑瓶上貼上標(biāo)簽，標(biāo)明代數(shù)、細(xì)胞類型、分開的數(shù)目和日期。
3． 在無菌條件下，小心地打開裝有生長培養(yǎng)液的補(bǔ)充培養(yǎng)瓶，按每5cm2表面加1升生長培養(yǎng)液的標(biāo)準(zhǔn)，無菌的把培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)液中。
4． 請(qǐng)擰松試劑蓋。如果用的不是可松動(dòng)的瓶蓋，擰緊瓶蓋，然后擰松到1/2圈。讓培養(yǎng)試管在37℃潮濕和裝有5%CO2的培養(yǎng)箱中溫育平衡至少30分鐘。
解凍貼壁細(xì)胞株
無菌條件下把定量的培養(yǎng)液加入試劑瓶中，并放入5%CO2和37℃的培養(yǎng)箱中平衡30分鐘。
1. 解凍以前準(zhǔn)備一個(gè)小型移液管。
2. 從倉庫中取出冷凍細(xì)胞管。在打開以前，用乙醇或異丙醇清洗冷凍管。無菌條件下，暫時(shí)旋轉(zhuǎn)瓶帽1/4圈以減輕內(nèi)部壓力，然后再旋緊。不要一下子打開冷凍瓶。
3. 拿著冷凍管，把冷凍管的3/4底部浸泡入37的水浴中并輕輕旋轉(zhuǎn)1-2分鐘直到內(nèi)容物解凍為止。湊近看冷凍管，當(dāng)zui后一條冰塊融化時(shí)，移走它。禁止把冷凍管*浸泡于水中。解凍細(xì)胞超過3分鐘會(huì)達(dá)不到理想的效果。
4. 迅速移出冷凍管，擦干并把它轉(zhuǎn)移到無菌環(huán)境下，此時(shí)平衡后的培養(yǎng)液正有待于細(xì)胞的移入。用70%的乙醇清洗冷凍管，然后擦干并移走多余的。
5. 注意解凍管中細(xì)胞的顏色。理想情況下，解凍管中細(xì)胞的顏色是粉紅的。如果顏色不是粉紅的，種植細(xì)胞并記下顏色。如果培養(yǎng)不成功，詢問一下您的技術(shù)專家，并把細(xì)胞的真實(shí)顏色告訴專家。
注示：
——如果每個(gè)冷凍管要解凍，一次解凍一個(gè)，并且使其他冷凍管放在液氮中。
——冷凍保存的細(xì)胞很嬌嫩。解凍后以zui少的撫摸盡可能快的速度把細(xì)胞放回培養(yǎng)液中。
——當(dāng)處理冷凍細(xì)胞時(shí)，戴上眼罩?？焖俚臏囟茸兓赡軐?dǎo)致液氮的飛濺。
——從防冷凍的混合液中移走細(xì)胞，離心過濾法不宜采用。離心過濾的損害性比DMSO殘留在培養(yǎng)液中更大。
——直接在玻璃滑板、格子板或多空離心板上解凍細(xì)胞是不合適的。如果zui初從冷凍保存中移植入T-25試管中，*的性能才能體現(xiàn)。如果更深一步了解，請(qǐng)遵循上述提供的細(xì)胞培養(yǎng)的方法。
種植貼壁細(xì)胞株
1． 打開瓶蓋，小心不要用手指碰到內(nèi)部的危險(xiǎn)物。
2． 用1000μl微型移液管定到800μl，把管尖插入冷凍管中，用移液管輕緩而平穩(wěn)地上下移液不超過5次以此來使細(xì)胞懸浮。決不要使細(xì)胞懸浮太快，把管尖插入到近底部以免產(chǎn)生氣泡。
3． 把細(xì)胞等量的分送到預(yù)備好的試劑瓶中。如果準(zhǔn)備的是四個(gè)T-25，把微型移液管調(diào)到250μl進(jìn)行分送；如果準(zhǔn)備的是八個(gè)T-25試劑瓶，把微型移液管調(diào)到125μl進(jìn)行分送。
4． 蓋上瓶塞，輕搖小管使細(xì)胞在管中均勻分布。如果有必要，擰松瓶塞允許氣體交換。
5． 把培養(yǎng)管放回5%的37℃的培養(yǎng)箱中。平放在架子上，使細(xì)胞能zui大程度地著壁。細(xì)胞將附著在試劑瓶表面的底部生長。
種植以后
細(xì)胞不能承受快速的溫度變化，也不能在營養(yǎng)缺乏的培養(yǎng)基上生長。用已經(jīng)溫化的新鮮生長培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞將會(huì)防止?jié)撛诘膯栴}（切記：僅溫化所需量的培養(yǎng)液）檢查和喂養(yǎng)下表中的細(xì)胞，即使在周末和假期。
1． 種植細(xì)胞的當(dāng)天，換一下生長培養(yǎng)液（移走殘留物和不貼壁細(xì)胞）然后當(dāng)每天檢查它們時(shí)，每隔一天換一次培養(yǎng)液。
2． 成功的重新利用培養(yǎng)液將會(huì)展現(xiàn)以下特點(diǎn)：
a.細(xì)胞質(zhì)是清晰的，無顆粒的
b.兩天后呈現(xiàn)出大量有絲分裂的形體。
3． 當(dāng)細(xì)胞變得更加融合時(shí)，用更多培養(yǎng)液喂細(xì)胞，用下表作為參考：
如果細(xì)胞是 然后喂它們
<25%融合 1ml/5cm2
25-45%融合 1.5ml/5cm2
>45%融合 2ml/5cm2
4.在達(dá)到70-90%融合以前，繼續(xù)喂養(yǎng)，如果特殊細(xì)胞株允許過度融合（比如說上皮細(xì)胞）并且在融合狀態(tài)下超過兩天，那么它們很難承受不可逆的接觸抑制，可以從燒杯中分離開來，很難使其受*的作用。

增殖貼壁細(xì)胞株
1． 在貨運(yùn)的過程中仔細(xì)檢查一下培養(yǎng)基有沒有短缺的信號(hào)。檢查相對(duì)細(xì)胞密度，估計(jì)百分融合度。根據(jù)收條，培養(yǎng)基應(yīng)該是30-100%的融合。有一些細(xì)胞分離是正常的。如果細(xì)胞看起來嚴(yán)重請(qǐng)立刻詢問您的技術(shù)專家。
2． 用70%的乙醇或異丙醇清洗細(xì)胞培養(yǎng)試劑瓶或多孔板的外表面。
3． 把密封試劑瓶或多孔板放入37℃、5%CO2的環(huán)境下3-4個(gè)小時(shí)，使之達(dá)到適宜的溫度。
4． 在無菌培養(yǎng)箱中把適量的生長培養(yǎng)液溫育到37℃。溫育整個(gè)瓶子能縮短培養(yǎng)液的壽命。不要在流動(dòng)的熱水下或難以控制的熱源下溫育培養(yǎng)基。決不要用微波傳送熱。
5． 無菌條件下，小心打開細(xì)胞培養(yǎng)試劑瓶或多孔板，移走培養(yǎng)液，換上溫暖新鮮的培養(yǎng)液。無菌條件下移走瓶頸或瓶蓋上的培養(yǎng)液，以免有細(xì)菌污染。
6． 如果試劑瓶上裝的是不透氣的瓶蓋，擰松瓶蓋，把試劑瓶放回到5%CO2和37℃濕潤的培養(yǎng)箱中，至少培養(yǎng)24小時(shí)。
次培養(yǎng)貼壁細(xì)胞株
次培養(yǎng)試劑的貯存信息
1． 次培養(yǎng)試劑經(jīng)過過濾消毒，在從Cambrex發(fā)送中心發(fā)送以前，一直貯存在-20℃的條件下。
2． 在運(yùn)輸過程中，次培養(yǎng)試劑可能會(huì)解凍。它們可能需要再次冷凍。
3． 再次解凍和冷凍后，次培養(yǎng)試劑貯存在-20℃的條件下可長達(dá)一年。
4． 為保持Trypsin/EDTA冷凍后新鮮性和活性，你可以把它分成部分裝入無菌離心管中再次冷凍到-20℃。Trypsin/EDTA可冷凍貯存一年。
5． HEPES-BSS和*中性溶液貯存在4℃條件下，保質(zhì)期一個(gè)月。
96孔培養(yǎng)板上的次培養(yǎng)
概要
正常人體細(xì)胞培養(yǎng)瓶要經(jīng)過*化作用和隨后的*抑制劑的處理。細(xì)胞離心后，懸浮在生長培養(yǎng)液中，同時(shí)可記數(shù)。既定數(shù)目的細(xì)胞移入96孔無菌組織培養(yǎng)板上。培養(yǎng)板在37℃、5%CO2和濕潤的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-3天，這樣細(xì)胞就可以貼壁和生長。種植密度根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)要求而定。多孔板上的細(xì)胞密度為10,000細(xì)胞/cm2理想。如要了解你正用的細(xì)胞株的特別信息，請(qǐng)參看細(xì)胞培養(yǎng)說明單。
冷凍保存的方法
冷凍保存可能會(huì)損害細(xì)胞的質(zhì)量和性能。細(xì)胞經(jīng)過冷凍保存后，其性能不能保證。這些說明不適用于CloneticsTM肝細(xì)胞或神經(jīng)始祖細(xì)胞。
方法：
1． 用分辨率為0.2的微量過濾細(xì)胞培養(yǎng)器無菌過濾冷凍培養(yǎng)液。
2． 把細(xì)胞收集起來并旋轉(zhuǎn)倒置。
3． 在大約500,000-2,000,000細(xì)胞/ml的冷凍液中再次使細(xì)胞懸浮。動(dòng)作要迅速。一旦置于DMSO下，細(xì)胞就會(huì)變得脆弱。
4． 用移液管等分成1ml裝入到冷凍管或瓶中。
5． 用Styrofoam®或丙醇冷凍罐使等分部分隔離。
6． 在-70℃條件下貯存細(xì)胞一夜。
7． 在12-24小時(shí)內(nèi)，可放在LN2（-200℃）中長期保存。在-70℃下延長保存會(huì)損害細(xì)胞。
以下是冷凍保存液：
通道細(xì)胞培養(yǎng)液的選擇
通道細(xì)胞培養(yǎng)液都是非血清培養(yǎng)液，適合于通道細(xì)胞的增殖?；九囵B(yǎng)基的每一種成分和每一種生長補(bǔ)充物都有Cambrex及其小組經(jīng)過認(rèn)真地測定，使之zui適于生長?？紤]到不同的性能要求和制作的靈活性，目前Cambrex提供了兩種適合于通道細(xì)胞生長的培養(yǎng)液。選擇培養(yǎng)基時(shí)，先看看特定的培養(yǎng)液說明書或者請(qǐng)教一下你的技術(shù)專家。
以下是培養(yǎng)液產(chǎn)品：
內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液的選擇
內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液都是低血清培養(yǎng)液，適合于內(nèi)皮細(xì)胞的增殖?；九囵B(yǎng)基的每一種成分和每一種生長補(bǔ)充物都有Cambrex及其小組經(jīng)過認(rèn)真地測定，使之zui適于生長?？紤]到不同的性能要求和制作的靈活性，目前Cambrex提供了四種適合于內(nèi)皮細(xì)胞生長的CloneticsTM培養(yǎng)液。選擇培養(yǎng)基時(shí)，先看看特定的培養(yǎng)液說明書或者請(qǐng)教一下你的技術(shù)專家。
以下是培養(yǎng)液產(chǎn)品：
纖維原細(xì)胞培養(yǎng)液的選擇
纖維原細(xì)胞培養(yǎng)液適合于纖維原細(xì)胞的增殖。基本培養(yǎng)基的每一種成分和每一種生長補(bǔ)充物都有Cambrex及其小組經(jīng)過認(rèn)真地測定，使之zui適于生長。考慮到不同的性能要求和制作的靈活性，目前Cambrex提供了兩種適合于纖維原細(xì)胞生長的培養(yǎng)液。選擇培養(yǎng)基時(shí)，先看看特定的培養(yǎng)液說明書或者請(qǐng)教一下你的技術(shù)專家。
以下是培養(yǎng)液產(chǎn)品：
以下是肝細(xì)胞培養(yǎng)液產(chǎn)品：
角化細(xì)胞培養(yǎng)液的選擇
角化細(xì)胞培養(yǎng)液適合于角化細(xì)胞的增殖。基本培養(yǎng)基的每一種成分和每一種生長補(bǔ)充物都有Cambrex及其小組經(jīng)過認(rèn)真地測定，使之zui適于生長?？紤]到不同的性能要求和制作的靈活性，目前Cambrex提供了三種適合于角化細(xì)胞生長的培養(yǎng)液。選擇培養(yǎng)基時(shí)，先看看特定的培養(yǎng)液說明書或者請(qǐng)教一下你的技術(shù)專家。
以下是培養(yǎng)液產(chǎn)品：
以下是淋巴細(xì)胞生長培養(yǎng)液（非血清）產(chǎn)品：
黑素細(xì)胞培養(yǎng)液的選擇
黑素細(xì)胞培養(yǎng)液適合于黑素細(xì)胞的增殖。基本培養(yǎng)基的每一種成分和每一種生長補(bǔ)充物都有Cambrex及其小組經(jīng)過認(rèn)真地測定，使之zui適于生長?？紤]到不同的性能要求和制作的靈活性，目前Cambrex提供了兩種適合于黑素細(xì)胞生長的培養(yǎng)液。選擇培養(yǎng)基時(shí)，先看看特定的培養(yǎng)液說明書或者請(qǐng)教一下你的技術(shù)專家。
以下是培養(yǎng)液產(chǎn)品：
以下是神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液（低血清）產(chǎn)品：
以下是前列腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液（非血清）產(chǎn)品：
以下是腎細(xì)胞培養(yǎng)液（低血清）產(chǎn)品：
以下是骨骼細(xì)胞培養(yǎng)液產(chǎn)品：
以下是骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)液（非血清）產(chǎn)品：
平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)液的選擇
平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)液適合于平滑肌細(xì)胞的增殖?；九囵B(yǎng)基的每一種成分和每一種生長補(bǔ)充物都有Cambrex及其小組經(jīng)過認(rèn)真地測定，使之zui適于生長。考慮到不同的性能要求和制作的靈活性，目前Cambrex提供了兩種適合于平滑肌細(xì)胞生長的培養(yǎng)液。選擇培養(yǎng)基時(shí)，先看看特定的培養(yǎng)液說明書或者請(qǐng)教一下你的技術(shù)專家。
以下是培養(yǎng)液產(chǎn)品：
以下是基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液（低血清）產(chǎn)品：
以下方法是針對(duì)25cm2試管來說的。對(duì)大小不同的試管，可相應(yīng)得調(diào)節(jié)溶液的體積。
準(zhǔn)備
準(zhǔn)備次培養(yǎng)的*個(gè)試劑瓶
1． 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70-90%融合并且在整個(gè)試劑瓶中包含大量有絲分裂形體后，次培養(yǎng)它們。
2． 次培養(yǎng)25cm2細(xì)胞
a.解凍2ml*/EDTA溶液并且使之達(dá)到室溫
b.使5ml的HEPES Buffeced Saline Solution(HEPES-BSS)溶液達(dá)到室溫
c.使4ml*中性溶液(TNS)達(dá)到室溫。
3． 從4℃的冰柜中取出生長培養(yǎng)液，使之達(dá)到室溫。
4． 準(zhǔn)備新的培養(yǎng)器皿
a) 準(zhǔn)備5-10T-25試劑瓶。所需試劑瓶的數(shù)目依據(jù)混合度和總產(chǎn)量而定。用大的試劑瓶可節(jié)省塑料器皿和接下來花在次培養(yǎng)上的時(shí)間。小的試劑瓶可以減少失去你培養(yǎng)液中有效成分的機(jī)率。
b) 像以前一樣，在每個(gè)試劑瓶上貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽上標(biāo)明代數(shù)、菌株數(shù)、細(xì)胞類型和日期。
c) 在無菌環(huán)境下，小心打開瓶口，按每5cm²表面加1ml生長培養(yǎng)液的標(biāo)準(zhǔn)，把生長培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)器皿中。
d) 如果沒用可排氣的瓶蓋，擰松瓶蓋。把新的培養(yǎng)器皿放到盛有5%CO237℃潮濕培養(yǎng)箱中，并使器皿置于此環(huán)境下至少30分鐘。
一次性培養(yǎng)一個(gè)試劑瓶，遵循化草案（在這個(gè)過程中以后解釋），所有試劑瓶中的細(xì)胞都應(yīng)在*個(gè)試劑瓶后被次培養(yǎng)。這種草案依據(jù)合適的細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞存活率和細(xì)胞密度而定。
在無菌環(huán)境下
（以T-25試劑瓶為例，對(duì)其它試劑瓶增加其相應(yīng)溶液體積就行）
1. 從一個(gè)培養(yǎng)器皿中吸收培養(yǎng)液
2. 用5ml室溫下的HEPES-BSS溶液漂洗細(xì)胞。不要忘記這一步，培養(yǎng)液中包含有能中和*的復(fù)雜蛋白質(zhì)。
3. 從試劑瓶中吸入HEPES-BSS溶液。
4. 用2ml*/EDTA溶液覆蓋細(xì)胞。
5. 擰緊瓶蓋，并且在顯微鏡下觀察試劑瓶中的細(xì)胞。
6. 顯微鏡下繼續(xù)檢查細(xì)胞層。
a. 將近90%的細(xì)胞被收集后，停止*作用。
注：收集的細(xì)胞呈球形的，有光滑的邊緣，并且能折射的或光亮的，如果細(xì)胞仍然粘附瓶壁，他們需要更長時(shí)間的*化，根據(jù)不同的細(xì)胞株，整個(gè)過程需要花費(fèi)2-6分鐘。
b. 此時(shí)，用手背輕敲試劑瓶使大量細(xì)胞從培養(yǎng)基表面釋放出來，如果僅有一些細(xì)胞分離，你的*化不足，等30秒后再次輕敲。如果細(xì)胞仍然不分離，此后每等30秒后，再次輕敲。
注：不要?jiǎng)×业剡祿粢云谕械募?xì)胞都從培養(yǎng)基表面脫離。這種行為將會(huì)損害細(xì)胞。
7. 細(xì)胞脫離后，用4ml室溫下的*中性溶液中和試劑瓶中的*。如果大量細(xì)胞沒有在幾分鐘內(nèi)分離，*要么沒有進(jìn)行足夠的溫化或沒有分離這些細(xì)胞的足夠活性，像上述那樣收集培養(yǎng)器皿，要么用新鮮溫暖的*/EDTA溶液再次*化，要么用*中性溶液漂洗，然后把新鮮溫暖的培養(yǎng)液加入到培養(yǎng)器皿中，接著把試劑瓶放回培養(yǎng)箱，直到新鮮的*化作用的試劑可用為止。
8. 快速把分離的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15ml無菌離心管中。
9. 用zui后2mlHEPES-BSS溶液漂洗試劑瓶，來收集殘余細(xì)胞，并把這些漂洗液放入離心管中。
10. 在顯微鏡下檢查一下已經(jīng)被收獲后的試劑瓶，如果試劑瓶中殘留的細(xì)胞數(shù)目不到5%，細(xì)胞收獲是成功的。
11. 數(shù)一下細(xì)胞并計(jì)算一下每毫升細(xì)胞數(shù)和整個(gè)試劑瓶中的細(xì)胞數(shù)。
12. 把浮在表面的東西加入到組織培養(yǎng)瓶中，輕輕地混合并把其放入到培養(yǎng)箱中。
你可以用下述步驟次培養(yǎng)細(xì)胞，你可以用臺(tái)盼藍(lán)估計(jì)細(xì)胞產(chǎn)量和存活力。
按照以下步驟：
1. 用血球計(jì)或細(xì)胞計(jì)數(shù)器數(shù)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)，記錄一下你的細(xì)胞數(shù)量以備后用。
為了獲得zui大的性，懸浮細(xì)胞液應(yīng)包含250.000—1.000.000細(xì)胞/毫升。
2. 如果必要，用HEPES-BSS稀釋懸浮液而得到需要的細(xì)胞數(shù)/毫升，再次數(shù)一下細(xì)胞。
3. 用臺(tái)盼藍(lán)估計(jì)細(xì)胞存活力。
4. 用以下等式?jīng)Q定總的細(xì)胞存活數(shù)。
=總的細(xì)胞數(shù)*百分存活率
5. 用以下等式?jīng)Q定接種試劑瓶中細(xì)胞總數(shù)，需要的試劑瓶中的數(shù)目依據(jù)細(xì)胞產(chǎn)量和種植密度而定。大的試劑瓶可節(jié)省塑料器皿和接下來次培養(yǎng)的時(shí)間。如果污染發(fā)生小的試劑瓶可減少失去培養(yǎng)液中有效成分的機(jī)率。建議種植密度為2500細(xì)胞/cm²，3500/cm²或5000/cm²
6. 用下面等式計(jì)算出你要種植的細(xì)胞懸浮液的體積。
7. 在每個(gè)試劑瓶中貼上標(biāo)簽，標(biāo)明代時(shí)，分開日期、細(xì)胞株和日期。
8. 小心打開培養(yǎng)瓶，按每5 cm²表面加1ml生長培養(yǎng)液的標(biāo)準(zhǔn)，把生長培養(yǎng)液加入到新的培養(yǎng)器皿中。
9. 用5ml移液管使稀釋細(xì)胞混合，確保懸浮液均衡，把上述計(jì)算過的懸浮液的體積分發(fā)到預(yù)備好的次培養(yǎng)試劑瓶中。
10. 分發(fā)細(xì)胞后，輕輕搖動(dòng)試劑瓶而促使細(xì)胞均衡分布。
11. 如果不用可透氣的瓶蓋，擰松瓶蓋，把新的培養(yǎng)器皿放入盛有5% CO2的37℃的有濕度的培養(yǎng)箱中
要求的材料：
1. 在70%-90%融合下的正常增殖人體細(xì)胞用的T-25試劑瓶
2. 96孔平底組織培養(yǎng)板。
3. 盛有5% CO2/95%空氣的37℃有濕度的培養(yǎng)箱。
4. 層流板或其他無菌環(huán)境。
5. 可調(diào)節(jié)的多孔道移液管（8或12孔）或重復(fù)使用的移液管。
6. 用多孔道移液管使將用的貯存箱無菌。
步驟：
1. 為準(zhǔn)備次培養(yǎng)和進(jìn)行次培養(yǎng)，請(qǐng)遵循以下步驟。
2. 因?yàn)榧?xì)胞數(shù)/毫升的計(jì)數(shù)是每毫升，所以細(xì)胞在植入96孔板之前，細(xì)胞濃度必須增加4倍，當(dāng)制作細(xì)胞懸浮液時(shí)，用生長培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度。
3. 把稀釋后的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到無菌貯藏瓶中。用裝有無菌移液尖的多孔（8或12孔）移液管，把250μl的稀釋細(xì)胞培養(yǎng)液加入到標(biāo)有96孔平底組織培養(yǎng)板的每一個(gè)孔中。每次分發(fā)植入細(xì)胞時(shí)，都要使細(xì)胞再次懸浮以確保細(xì)胞在瓶中分布均衡，使細(xì)胞再次懸浮的辦法是用移液管在瓶中上下移動(dòng)幾次。
4. 在37℃/5% CO2的培養(yǎng)箱中，蓋上培養(yǎng)板并培養(yǎng)1-3天。（培養(yǎng)期超過三天通常不被采用，因?yàn)榘蹇走吘壟囵B(yǎng)液的蒸發(fā)）
注：在生物測定中，在用96孔板培養(yǎng)以前，在顯微鏡下觀察有絲分裂的存在，以確保細(xì)胞恢復(fù)了活性生長。
提高細(xì)胞產(chǎn)量和存活力
幾種因素或因素的綜合使細(xì)胞產(chǎn)量和存活力降低，如果不滿意細(xì)胞產(chǎn)量或存活力，用以下信息增加日后培養(yǎng)的成功率。
提高細(xì)胞產(chǎn)量
如果細(xì)胞產(chǎn)量低（少于50%），用下表找到原因和可能的解決辦法。運(yùn)用合適的方法次培養(yǎng)多個(gè)試劑瓶。
解凍CD34+和前體細(xì)胞的步驟：
1. 溫化含有10%FBS或1%BSA的培養(yǎng)液，對(duì)單核細(xì)胞來說，Dnase也能被加進(jìn)去。
2. 在37℃水浴中快速解凍冷凍細(xì)胞，用70%異丙醇擦洗試管的外部。
3. 無菌條件下把2mlzui大量的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到50ml圓錐形的試管中。對(duì)于一百萬個(gè)細(xì)胞或更少用15ml圓錐形小管。
4. 用1ml培養(yǎng)液漂洗小管，當(dāng)輕輕搖動(dòng)試管（約1分鐘）的過程中，把懸浮液逐滴加入細(xì)胞中。
5. 每加入一次培養(yǎng)液，都要輕輕旋轉(zhuǎn)一會(huì)兒（約3分鐘），慢慢地逐滴加入直到是5ml培養(yǎng)液于細(xì)胞中。
6. 每加入一次培養(yǎng)液，都要輕輕旋轉(zhuǎn)一下（約5-10分鐘），慢慢地逐滴加入1-2ml培養(yǎng)液使試管充滿。
7. 在室溫下，以zg的情況使細(xì)胞懸浮液離心15分鐘。
8. 用移液管小心移去大多數(shù)洗液，留下幾毫升，這樣細(xì)胞顆粒不會(huì)被干擾，輕輕搖動(dòng)使培養(yǎng)液的細(xì)胞顆粒懸浮。如果你用50ml試管，把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15ml圓錐形管中，要用5ml培養(yǎng)液漂洗50ml試管，慢慢地把5ml沖洗培養(yǎng)液加入到細(xì)胞懸浮液中，同時(shí)輕搖。
9. 慢慢地加入1-2ml體積培養(yǎng)液使試管充滿，同時(shí)加入以后都要輕搖一下。
10. 室溫情況下，離心細(xì)胞懸浮液15分鐘。
11. 用移液管小心地移走洗液，僅留2ml洗液，輕輕地再次使裝在2ml培養(yǎng)液的細(xì)胞顆粒懸浮并計(jì)數(shù)，如果細(xì)胞數(shù)目低于預(yù)計(jì)的，在8級(jí)更高速度下，離心保留下來的洗液，計(jì)數(shù)并且在必要的情況下合并。
12. 在37℃和5% CO2下使細(xì)胞休息1小時(shí)，再次數(shù)一下細(xì)胞，細(xì)胞有待于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
CloneticsTM培養(yǎng)基系統(tǒng)
培養(yǎng)基為正常人體細(xì)胞的特殊類型的*化生長而制作的?？梢韵荣I無補(bǔ)充物的基本培養(yǎng)基，再加入補(bǔ)充的生長培養(yǎng)基，或方便地購買包裝好的Bulletkits®試劑，它能允許用戶控制補(bǔ)充液類型和濃度。每種培養(yǎng)基經(jīng)檢驗(yàn)都能支持預(yù)定正常人體細(xì)胞的生長。每塊培養(yǎng)基的性能都經(jīng)過生化和無菌檢驗(yàn)，對(duì)于所要的培養(yǎng)基產(chǎn)品，都有分析合格證書。
基本培養(yǎng)基
基本培養(yǎng)基適用于正常人體細(xì)胞特別類型培養(yǎng)。基本培養(yǎng)基不包含細(xì)胞增殖必要生長因子。生長因子必須被加入以增強(qiáng)效能和細(xì)胞增殖。許多Clonetics培養(yǎng)基從Richard Ham實(shí)驗(yàn)室中制造出來的。該實(shí)驗(yàn)室屬于Colorado大學(xué)的分子與細(xì)胞發(fā)育生物學(xué)系。新的和改良的人體細(xì)胞培養(yǎng)基也是在我們的培養(yǎng)基研制室有規(guī)律的制造出來。優(yōu)化制作使得正常人體細(xì)胞株在更廣泛的研究成為可能。這幾年培養(yǎng)基的發(fā)展對(duì)你自己研究更有利。
*培養(yǎng)基
*培養(yǎng)基補(bǔ)充有生長培養(yǎng)基，并且包含所有的生長因子和有助于正常人體特殊細(xì)胞株增殖的必要補(bǔ)充物。沒介定的補(bǔ)充物在可能情況下可以避免，當(dāng)有必要時(shí)可以zui低的標(biāo)準(zhǔn)用，所有生長培養(yǎng)基的基本制作包括有抗菌劑，訂購抗菌劑的培養(yǎng)基可作特殊訂購。
Bulletkits
Bulletkits提供了培養(yǎng)基的zui后制作程序的靈活性，而是增加了保存期限，每個(gè)Bulletkit包含基本培養(yǎng)基和預(yù)先測定的單獨(dú)用的生長因子和抗菌劑，以此來制成你選擇的補(bǔ)充生長培養(yǎng)基。
特定培養(yǎng)基
Cambrex的正常培養(yǎng)基制作實(shí)驗(yàn)室允許你選擇的培養(yǎng)基成分的濃度改變。特定培養(yǎng)基牽涉到庫存培養(yǎng)液的再制作，培養(yǎng)液包含氨基酸、維生素、微量礦物、鹽類、糖類和對(duì)細(xì)胞代謝必需的其他相對(duì)穩(wěn)定的生化物質(zhì)。根據(jù)你的要求，特定生長因子和你自己需要的額外成分也能被加入制成培養(yǎng)基。Cambrex也研制出了非血清或低血清的培養(yǎng)基以備你選擇的人體細(xì)胞株生長。請(qǐng)咨詢。
BEGM®Bulletkit®
基本培養(yǎng)基以MCDB-151和LHC-9制作的改動(dòng)為基礎(chǔ)。
支氣管上皮細(xì)胞的生長的培養(yǎng)液包含抗菌劑SAGMTM Bulletkit
用CCMD-161制作方法，基本培養(yǎng)被研制出來。
小的通道上皮細(xì)胞和支氣管的上皮細(xì)胞的無抗菌劑培養(yǎng)液的生長。
EGMTM和EGM Bulletkit®
基本培養(yǎng)基以有少許改動(dòng)的MCDB-131的制作為基礎(chǔ)；以低血清的環(huán)境下制成正常人體內(nèi)皮細(xì)胞。
EGM是補(bǔ)充生長培養(yǎng)液，包括牛腦提取液的粘附部分。
EGM Bulletkit包括有附加成分的基本培養(yǎng)基和分升冷凍包裝的生長因子。
zui終血清濃度是2%
EGN可用來培養(yǎng)所有的除微血管、冠狀動(dòng)脈和臍動(dòng)脈以外的Clonetics內(nèi)皮細(xì)胞。
EGM-MV Bulletkit
適合微血管和冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞
像EGM一樣，也是基本培養(yǎng)基
zui終血清濃度為5%
EGM-MV可用來培養(yǎng)除HMVEC-L之外的所有的Clonetics內(nèi)皮細(xì)胞
EGM-2 Bulletkit
提純后的基本培養(yǎng)基和生長因子
不包含BBE
zui終血清濃度為2%
此EGM能提高細(xì)胞的增殖
EGM可用來培養(yǎng)除微血管和冠狀動(dòng)脈之外的所有Clonetics內(nèi)皮細(xì)胞
EGM-I-MV Bulletkit
適合增強(qiáng)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長
不包含BBE
zui終血清濃度增加到5%
EGM-I-MV能用來種植所有的Clonetics內(nèi)皮細(xì)胞
FGM®Bulletkit®
依據(jù)MCDB-202的配方設(shè)計(jì)的基本培養(yǎng)基
FGM是特定的不包含血清的培養(yǎng)基系統(tǒng)
FGM-2 Bulletkit
依據(jù)MCDB-202的配方設(shè)計(jì)的基本培養(yǎng)基
包含F(xiàn)BS的單個(gè)成分，zui終血清濃度為2%
KGM®和KGM Bulletkit®
依據(jù)有改動(dòng)的MCDB-153配方設(shè)計(jì)的基本培養(yǎng)基，適合于在非血清環(huán)境下Clonetics正常人體角化細(xì)胞的生長。
KGM包括補(bǔ)充培養(yǎng)基和牛垂體提純物的粘附部分
KGM Bulletkit包括所有補(bǔ)充成分的基本培養(yǎng)基和分開冷凍保存的生長因子
KGM培養(yǎng)所有CloneticsTM角化細(xì)胞
BGM-2 Bulletkit®
依據(jù)有改動(dòng)的MCDB-153的配方設(shè)計(jì)的基本培養(yǎng)基，用來培養(yǎng)正常新生兒的黑素細(xì)胞
非血清
牛垂體提取液（BPE），7.5mg/ml
基本鈣濃度降到0.5ml
BGM-3 Bulletkit
依據(jù)有改動(dòng)的MCDB-153的配方設(shè)計(jì)的基本培養(yǎng)基，用來提高新生兒和成人黑素細(xì)胞的生長率
zui終血清濃度為0.5‰
zui終基本鈣濃度為0.5ml
MGM-3用來培養(yǎng)所有的黑素細(xì)胞
SmGM-2 Bulletkit®
依據(jù)有改動(dòng)的MCDB-133的配方設(shè)計(jì)的基本培養(yǎng)基，適合在低血清下培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞
SmGM-2 Bulletkit更有利于細(xì)胞形態(tài)和增殖
*被移走后，所有生長因子re-titered，同時(shí)，加入胰島素
zui終血清濃度為5%
SMGM-2可培養(yǎng)所有平滑肌細(xì)胞
SmGM-3 Bulletkit
該培養(yǎng)基在平滑肌細(xì)胞分離中選擇性更強(qiáng)
降低分化細(xì)胞的同時(shí)，進(jìn)一步增強(qiáng)增殖
對(duì)基本培養(yǎng)基是一種調(diào)節(jié)
更特定的培養(yǎng)基，zui終血清濃度為0.5%
FBS:Fetal Bovine Serum,胎牛血清；
Defined FBS：特級(jí)胎牛血清，經(jīng)過40納米過濾的*胎牛血清。的促細(xì)胞生長作用及產(chǎn)品穩(wěn)定性。內(nèi)毒素含量<10EU/ml，血紅蛋白含量<10mg/dl。
Characterized FBS：優(yōu)等胎牛血清，經(jīng)過三次100納米過濾。內(nèi)毒素含量<25EU/ml，血紅蛋白含量<25mg/dl。
Standard FBS：標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，經(jīng)三次100納米過濾的高品質(zhì)胎牛血清。低內(nèi)毒素和血紅蛋白含量。優(yōu)良的性能價(jià)格比。
Certified New Zealand FBS：新西蘭胎牛血清，原料血產(chǎn)于新西蘭。由HyClone公司加工生產(chǎn)，*符合HyClone公司質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)。內(nèi)毒素含量<20EU/ml，血紅蛋白含量<25mg/dl。
Charcoal Dextran Treated FBS：活性炭/葡聚糖處理的胎牛血清，經(jīng)過活性炭/葡聚糖處理，使各種激素含量大大降低。內(nèi)毒素含量<10EU/ml，血紅蛋白含量<20mg/dl。
Dialyzed FBS：透析型胎牛血清，以10000分子量為分離點(diǎn)的過濾系統(tǒng)過濾，使次黃嘌呤和胸腺核苷降低到正常測定方法檢測不到的超低含量。內(nèi)毒素含量<10EU/ml，血紅蛋白含量<10mg/dl。
Low IgG FBS：天然低IgG胎牛血清，由天然發(fā)生（非經(jīng)化學(xué)方法清除）的低IgG含量血清收集起來統(tǒng)一加工而成。IgG含量低于20mg/ml尤其適合于單克隆抗體的生產(chǎn)。經(jīng)40納米過濾。內(nèi)毒素含量<25EU/ml，血紅蛋白含量<25mg/dl。
ES Cell Screened Defined FBS：胚胎干細(xì)胞特級(jí)胎牛血清，專為胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)而篩選的zui高品質(zhì)的特級(jí)胎牛血清。經(jīng)40納米過濾。內(nèi)毒素含量<10EU/ml，血紅蛋白含量<10mg/dl。
Insect Cell Screened Defined FBS：昆蟲細(xì)胞特級(jí)胎牛血清，于SF-9等昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)而優(yōu)選的zui高品質(zhì)的特級(jí)胎牛血清。尤其適用于桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)進(jìn)行重組蛋白生產(chǎn)。經(jīng)40納米過濾。內(nèi)毒素含量<10EU/ml，血紅蛋白含量<10mg/dl。