流式細(xì)胞術(shù)的基本理論

1. 工作原理 流式細(xì)胞儀主要由流動(dòng)室及液流系統(tǒng)、激光器及光學(xué)系統(tǒng)、光電管及檢測(cè)系統(tǒng)、計(jì)算機(jī)及分析系統(tǒng)四個(gè)部分組成，見(jiàn)圖18-1。

待測(cè)細(xì)胞被制備成單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后置于樣品管中，在氣體壓力推動(dòng)下被壓入流動(dòng)室，流動(dòng)室內(nèi)充滿鞘液（不含細(xì)胞或微粒的緩沖液），在高壓作用下從鞘液管噴出包裹細(xì)胞，使細(xì)胞排成單列形成細(xì)胞液柱，依次通過(guò)檢測(cè)區(qū)。液柱與高度聚焦的激光束垂直相交，被熒光染料染色的細(xì)胞受到激光激發(fā)產(chǎn)生熒光信號(hào)和散射光信號(hào)，這些光信號(hào)通過(guò)波長(zhǎng)選擇的濾光片，由相應(yīng)的光電管和電子檢測(cè)器接收并轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，經(jīng)放大器放大后送入計(jì)算機(jī)并進(jìn)行分析顯示和結(jié)果輸出。

帶有細(xì)胞分選功能的流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞的分選是由分選器來(lái)完成。待分選的細(xì)胞在形成液滴時(shí)被充以特定的電荷，并通過(guò)超高頻的壓電晶體產(chǎn)生高頻振蕩，使液柱斷裂成均勻的液滴，帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板的高壓靜電場(chǎng)時(shí)，按照所帶電荷發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入的收集器內(nèi)，完成分類收集的目的。

2. 光學(xué)原理　流式細(xì)胞儀的光學(xué)系統(tǒng)由激光器和若干組透鏡、濾光片等光學(xué)元件及光學(xué)通路組成，細(xì)胞帶有的特異熒光染色經(jīng)激光器的激發(fā)，通過(guò)不同的光學(xué)元件將不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)送入到相應(yīng)的電子探測(cè)器。

流式細(xì)胞儀的激光器以氬離子激光器常見(jiàn)，光學(xué)元件主要是分色反射鏡（DL）和濾光片（Filter），它們主要分為三類：長(zhǎng)通濾片（long-pass filter，LP）、短通濾片（short-pass filter，SP）和帶通濾片（band- pass filter，BP）。

（1） 分色反射鏡（488DL、 550DL、 600DL、640DL）：用于選擇被測(cè)熒光波長(zhǎng)，只允許大于特定波長(zhǎng)的光通過(guò)，而將小于特定波長(zhǎng)的光反射到光電檢測(cè)器。

（2） 長(zhǎng)通濾片：只允許特定波長(zhǎng)以上的光通過(guò)，特定波長(zhǎng)以下的光不能通過(guò)。如LP620nm濾片，只允許620nm以上的光通過(guò)，而620nm以下的光被吸收或返回。

（3） 短通濾片：與長(zhǎng)通濾片相反，允許特定波長(zhǎng)以下的光通過(guò)，而特定波長(zhǎng)以上的光被吸收或返回。

（4） 帶通濾片（488BP、525BP、575BP、675BP）： 允許某一特定波長(zhǎng)的光線通過(guò)，而其他波長(zhǎng)的光全部被阻斷。

例如，F(xiàn)ITC染料發(fā)射出525nm的綠色熒光，PE染料發(fā)射出575nm的橙色熒光，分別選擇550DL和525BP組成的濾片組和600DL和575BP濾片組，即可達(dá)到特異地接收FITC和PE熒光信號(hào)的目的。光電倍增管和硅光電二極管，可分別將側(cè)向散射光和前向散射光以及525～675等不同的熒光信號(hào)收集檢測(cè)。

3. 參數(shù)測(cè)量　流式細(xì)胞儀可同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，信息主要來(lái)自特異性熒光信號(hào)及非熒光散射信號(hào)。

（1）散射光測(cè)量：細(xì)胞在通過(guò)測(cè)量區(qū)時(shí)由于受光照射會(huì)向空間360°立體角的所有方向散射光線，散射的信號(hào)與細(xì)胞的大小、形狀、質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)部的折射率有關(guān)，與收集散射光的方向也有關(guān)。在流式細(xì)胞術(shù)中一般采用0°前向散射光（forward scatter, FS）和90°側(cè)向散射光（side scatter，SS）。前向散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞大小有關(guān)，對(duì)于同一個(gè)細(xì)胞群體，散射光強(qiáng)的細(xì)胞大一些；而散射光弱的細(xì)胞小一些。側(cè)向散射光對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，對(duì)胞質(zhì)內(nèi)較大的顆粒也有反應(yīng)，可獲得有關(guān)細(xì)胞內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)及膜表面光滑程度的有關(guān)信息。圖18-2是利用流式細(xì)胞儀前向散射光和側(cè)向散射光測(cè)得的全血白細(xì)胞二維點(diǎn)圖，由圖中可見(jiàn)，利用FS和SS可將白細(xì)胞群中不同細(xì)胞群分開(kāi)，得到很清楚的三群細(xì)胞。

（2）熒光測(cè)量：熒光信號(hào)主要包括兩部分：①自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細(xì)胞內(nèi)部的熒光分子經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光。細(xì)胞成分中能夠產(chǎn)生的自發(fā)熒光的分子（例核黃素、細(xì)胞色素等）的含量越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；培養(yǎng)細(xì)胞中死細(xì)胞/活細(xì)胞比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)。②特征熒光，即由細(xì)胞經(jīng)染色結(jié)合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光。用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的特征熒光時(shí)，自發(fā)熒光對(duì)所測(cè)定特征熒光是一種本底信號(hào)，應(yīng)設(shè)定陰性對(duì)照樣品加以去除，同時(shí)應(yīng)盡可能地通過(guò)選用較亮的熒光染料染色細(xì)胞、選用適宜的激光和濾片光學(xué)系統(tǒng)、采用電子補(bǔ)償電路等方法提高信號(hào)/噪聲比，以減少自發(fā)熒光的干擾，這是在樣品處理與測(cè)量中應(yīng)特別注意的問(wèn)題。

熒光補(bǔ)償：對(duì)于雙標(biāo)記或三標(biāo)記熒光染色的樣品，在應(yīng)用FCM測(cè)量時(shí)需要對(duì)熒光信號(hào)的光譜重疊部分進(jìn)行校正，特別是在實(shí)際測(cè)量中當(dāng)兩波長(zhǎng)比較接近，如FITC發(fā)射的525nm熒光和PE發(fā)射的575nm熒光會(huì)發(fā)生交叉干擾，而使被測(cè)信號(hào)失真，測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生較大的誤差，因此需采用熒光補(bǔ)償方法來(lái)解決這種交叉重疊的問(wèn)題。目前生產(chǎn)廠家都提供有熒光補(bǔ)償?shù)膶?shí)用程序，用廠商的488nm激光激發(fā)的三種熒光染料（FITC、PE、PerCP），在測(cè)量中加以正確補(bǔ)償即可比較容易達(dá)到正確測(cè)量熒光信號(hào)的目的。

4. 測(cè)量參數(shù)分析　流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)顯示方式包括單參數(shù)直方圖（histogram）、二維點(diǎn)圖（dot plot）、二維等高圖（contour）、假三維圖（pseudo 3D）等。

（1）單參數(shù)直方圖：是流式細(xì)胞術(shù)使用zui多的一種分析方法，它主要用來(lái)分析細(xì)胞相對(duì)數(shù)與測(cè)量參數(shù)之間的關(guān)系（圖18-3）。只能顯示一個(gè)參數(shù)與細(xì)胞之間的關(guān)系是它的局限性。

（2）二維點(diǎn)圖：二維點(diǎn)圖能夠顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)與細(xì)胞相對(duì)數(shù)之間的關(guān)系。橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)分別為與細(xì)胞有關(guān)的兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)，平面上每一個(gè)點(diǎn)表示同時(shí)具有相應(yīng)坐標(biāo)值的細(xì)胞存在。但對(duì)細(xì)胞點(diǎn)密集的地方就難于顯示它的精細(xì)結(jié)構(gòu)（圖18-4）。

（3）等高線圖和密度圖：可以同時(shí)表達(dá)檢測(cè)參量和細(xì)胞頻度，等高線圖是將代表相同細(xì)胞數(shù)目的點(diǎn)依次連接起來(lái)形成密閉的曲線，越在里面的曲線代表的細(xì)胞數(shù)目越多（圖18-5）；密度圖則依據(jù)細(xì)胞分布的密度大小，細(xì)胞密度大的地方點(diǎn)的密度大，使數(shù)據(jù)的顯示更直觀。

（4）假三維圖：利用計(jì)算機(jī)技術(shù)將原二維圖中的隱坐標(biāo)-細(xì)胞數(shù)同時(shí)顯現(xiàn)，能多方位地觀察“山峰”和“谷地”的結(jié)構(gòu)和細(xì)節(jié)，更為直觀，有助于對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

5. 使用流式細(xì)胞儀注意事項(xiàng)

（1）光電倍增管要求穩(wěn)定的工作條件，暴露于較強(qiáng)的光線下以后，需要較長(zhǎng)時(shí)間的“暗適應(yīng)”以消除或降低部分暗電流本底才能工作；另外還要注意磁屏蔽。

（2）使用光源必須預(yù)熱并注意冷卻系統(tǒng)工作是否正常，光源不得在短時(shí)間內(nèi)（一般1h左右）反復(fù)開(kāi)關(guān)。

（3）液流系統(tǒng)必須隨時(shí)保持液流暢通，避免氣泡栓塞，所使用的鞘液使用前要經(jīng)過(guò)過(guò)濾、消毒。

（4）注意根據(jù)測(cè)量對(duì)象的變換選用合適的濾片系統(tǒng)、放大器的類型等。

（5）每次測(cè)量都需要設(shè)立對(duì)照組。